技术指标
外观:白色无定型冻干粉末;蛋白纯度:≥90%;比活性:≥25U/mg酶粉;葡萄糖6磷酸脱氢酶:≤0.01%;乳酸脱氢酶:≤0.%;谷氨酸脱氢酶:≤0.%;苹果酸脱氢酶:≤0.01%;己糖激酶:≤0.01%
酶学性质
来源:微生物;分类:EC1.1.1.50;分子量:30kDa(SDS-PAGE);等电点:5.2;Km值:3.6×10-5M(雄酮),4.7×10-5M(NAD+);抑制剂:Cu2+,Ag+,Hg2+,Zn2+,Fe3+;最适pH
.5-9.5;
最适温度:55℃;pH稳定性:6.0-9.0(25℃,16h);热稳定性:37℃以下稳定(pH9.0,30min);稳定性:-25~-15℃静置保存12个月保持90%以上活性;保护剂:BSA.
用途:用于总胆汁酸(TBA)试剂的研发和大量制备。
酶活定义:单位酶活定义为在下述条件下,每分钟催化生成1μmolNADH所需的酶量。
试剂准备
试剂I:0.1M焦磷酸钠(用HCl调pH至8.9)。
试剂II:将mgNAD+溶解至25mL双蒸水中,用固体NaHCO3调节pH至7.0-7.5,用双蒸水定容至30mL。
试剂III:将30mg溶解至mL甲醇中。
酶稀释液:10mMTris-HCl,pH9.0。
操作步骤
1.向3mL比色皿中依次加入2.6mL试剂I,0.2mL试剂II,0.1mL试剂III,混匀。
2.将反应混合物在25℃预热5min。
3.向反应混合物中加入0.1mL酶液,混匀,
25℃反应,并用分光光度计在nm下,记录1min内的吸光度变化(ΔAs)
*用酶稀释液替代酶液,其它步骤相同,所得溶液吸光度为空白吸光度(ΔAb)ΔA=ΔAs-ΔAb