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HOXB-AS3肽拮抗hnRNPA1刺激的CRC生长
为了研究hnRNPA1对癌症表型的影响，沉默了hnRNPA1的表达（图5A）。作者发现沉默hnRNPA1可抑制CRC细胞的生长，集落形成，迁移和侵袭（图5B-D），与HOXB-AS3肽过表达诱导的癌症表型一致。
为了研究HOXB-AS3肽对hnRNPA1功能的影响，将HOXB-AS3ORF-Flag（表达HOXB-AS3肽）或ORFmut-Flag（MUT，表达HOXB-AS3lncRNA）构建体与hnRNP共表达CRC细胞中的A1（图5E）。作者发现HOXB-AS3肽而非HOXB-AS3lncRNA拮抗了hnRNPA1过表达诱导的细胞生长，集落形成，迁移和侵袭的增强（图5F-H）。
总体而言，作者的数据表明HOXB-AS3肽通过与hnRNPA1结合而减弱了hnRNPA1的致癌特性。
图5
作者发现，HOXB-AS3肽和HOXB-AS3lncRNA均未改变hnRNPA1蛋白的水平（图6A）。为了研究HOXB-AS3肽对hnRNPA1结合PKME9的能力的影响，作者使用5生物素标记的RNA进行了RNA亲和层析，该RNA对应于包含UAGGGC序列EI9（50-68）的EI9（50-68）G3C（UAGGGC中G3核苷酸向C的突变）或EI9（1-20）（阴性对照）。观察到hnRNPA1与PKM的EI9（50–68）序列有强力结合，而EI9（50–68）的G3核苷酸与C的突变导致不与hnRNPA1结合（图6B）。作者发现HOXB-AS3肽未直接结合PKM的mRNA序列（图6B），这与图4C和4D中的结果一致，其中在存在RNaseA的情况下，HOXB-AS3仍与hnRNPA1相互作用。这表明HOXB-AS3肽以RNA无关的方式直接与hnRNPA1结合。当HOXB-AS3过表达时，hnRNPA1与PKM的EI9（50-68）的结合被完全阻断（图6C）。此外，HOXB-AS3肽以剂量依赖性方式阻断hnRNPA1与PKM的EI9（50-68）的结合（图6D）。
为了研究hnRNPA1的哪个结构域与PKM的EI9（50-68）结合，在HEKT细胞中异位表达HA标记的hnRNPA1及其截短的构建体，并使用与EI9对应的5生物素标记的RNA进行RNA亲和层析。仅包含RGG框结构域的构建体，而不包含hnRNPA1的其他区域，与PKM的EI9序列结合，这表明hnRNPA1的RGG框对于与PKM的EI9序列结合是必不可少的（图6E）。作者进一步表明hnRNPA1AGG突变体不与PKMmRNA序列结合（图6F），表明hnRNPA1也通过hnRNPA1的RGG基序中的精氨酸残基与RNA结合。此外，HOXB-AS3肽的表达阻断了hnRNPA1的RGG盒与PKM的EI9序列的结合（图6G）。总体而言，作者的结果表明，HOXB-AS3肽通过竞争性结合hnRNPA1的RGG基序中的精氨酸残基来阻断hnRNPA1与PKMmRNA的结合。
图6
检测HnRNPA1蛋白阻遏列入PKM通过结合在E19序列E9PKM，从而促进同种型PKM2的形成。作者的数据表明，HOXB-AS3肽阻断了hnRNPA1与PKM基因的EI9的结合。这样，在HOXB-AS3肽作用PKM随后剪接通过RT-PCR进行了进一步研究通过限制性消化来评估PKM1和PKM2水平（图S7A）。作者发现，HOXB-AS3肽而不是HOXB-AS3lncRNA降低了PKM2mRNA和蛋白的水平，并增加了PKM1mRNA和蛋白的水平（图7A、6A及S7B）。相比之下，HOXB-AS3沉默导致相反的现象（图7B）。
为了进一步确定HOXB-AS3肽是否阻断hnRNPA1对PKM2形成的刺激作用，在HEKT细胞中将HOXB-AS3ORF或ORFmut与hnRNPA1共表达。HOXB-AS3肽而不是HOXB-AS3lncRNA减弱了hnRNPA1过表达诱导的PKM2mRNA和蛋白质的增加以及PKM1mRNA和蛋白质的减少（图5E和7C）。
接下来，作者试图确定在临床CRC组织中HOXB-AS3肽的表达与PKM的可变剪接是否相关。分析了六对匹配的新鲜CRC组织和相应的结肠NT组织中的PKM1和PKM2mRNA水平。与相应的结肠NT组织相比，CRC组织中PKM2mRNA升高，PKM1mRNA水平降低(图S7C)。PKM1和PKM2mRNA水平分别与样本组织中HOXB-AS3肽水平呈正相关(R=0.,p=0.)和负相关(R=0.,p=0.)(图7G)。
先前的报道表明，hnRNPA1是miR-18a处理所必需的。因此，将进一步研究HOXB-AS3肽对hnRNPA1加工miR-18a的影响。发现HOXB-AS3肽，而不是HOXB-AS3lncRNA，抑制了miR-18a的加工(图S7E)，而沉默HOXB-AS3促进了miR-18a的产生(图S7F)。HOXB-AS3肽，而非HOXB-AS3lncRNA，可减弱hnRNPA1过表达诱导的miR-18a生成的增强(图S7G)。这些数据表明，除了mRNA剪接外，HOXB-AS3还抑制hnRNPA1对miRNA生物发生的功能。总体而言，作者的结果表明，HOXB-AS3肽而非HOXB-AS3lncRNA抑制了hnRNAA1依赖性PKM剪接，PKM2同工型形成和miR-18a产生。
补充图S7
本文涉及技术：流式细胞术
本文涉及技术：多重免疫组化
本文涉及技术：单/多因子检测
HOXB-AS3肽抑制hnRNPA1依赖的有氧糖酵解
PKM2的表达是癌症代谢表型的关键决定因素，并赋予体内肿瘤细胞选择性的增殖优势。为了测试hnRNPA1是否通过PKM剪接介导HOXB-AS3的作用，将HOXB-AS3ORF-Flag或ORFmut-Flag（MUT）构建体与PKM2在细胞中共表达，以及细胞生长，集落形成，迁移和入侵已确定。PKM2过表达促进CRC细胞生长，集落形成，迁移和侵袭。HOXB-AS3肽而不是HOXB-AS3lncRNA拮抗由PKM2过表达诱导的细胞生长，集落形成，迁移和侵袭的增强（图7D-F）。
PKM2是有氧糖酵解和乳酸产量增加的关键决定因素。为了测试导致PKM2减少和PKM1增加的HOXB-AS3肽是否足以改变CRC细胞的代谢，作者测量了CRC细胞中乳酸产生的程度。HOXB-AS3肽而不是HOXB-AS3lncRNA降低了乳酸的产生（图7H），而沉默HOXB-AS3则增加了乳酸的产生（图7I）。作者进一步表明，沉默hnRNPA1会降低乳酸的产生，而hnRNPA1的过表达会增加乳酸的产生（图7J-K）。HOXB-AS3肽而非HOXB-AS3lncRNA减弱了hnRNPA1过表达诱导的乳酸生成的增强（图7K）。如所预期的，PKM2过表达增加了乳酸的产生（图7L）。HOXB-AS3肽而非HOXB-AS3lncRNA减弱了由PKM2过表达诱导的乳酸生成的增强（图7L）。综上所述，这些结果表明，HOXB-AS3肽而非HOXB-AS3lncRNA通过抑制hnRNPA1依赖性PKM剪接来抑制CRC细胞有氧糖酵解。
总结
真核转录物的很大一部分是长的非编码RNA（lncRNA），调节各种癌症特征。作者发现lncRNAHOXB-AS3编码保守的53-aa肽。HOXB-AS3肽而非lncRNA抑制结肠癌（CRC）的生长。从机理上讲，HOXB-AS3肽与hnRNPA1的RGG基序中的甘氨酸残基竞争性结合，并通过阻断hnRNPA1的RGG基序中的甘氨酸残基与RNRA1介导的丙酮酸激酶M（PKM）剪接而拮抗。PKM侧翼的序列外显子9，确保形成较低的PKM2并抑制葡萄糖代谢重编程。低水平HOXB-AS3肽的CRC患者预后较差。研究表明，HOXB-AS3肽的丢失是CRC代谢重编程中的关键致癌事件。作者的发现揭示了由lncRNA编码的肽精心策划的癌症代谢重编程的复杂调控机制。
本文涉及技术：流式细胞术
本文涉及技术：多重免疫组化
本文涉及技术：单/多因子检测
