小白:害,买了抑制剂和激动剂,储备液倒是配好了,可是不知道咋加药。总不能一起怼进去细胞培养基吧?师兄:铁汁儿!事事有依据,要看文献的。上面的问题,相信很多初次接触小分子抑制剂(激动剂)的小伙伴肯定会遇到。萌Cece我,作为一个小可爱,分享科研路上加药三步法:明确实验目的,文献查阅浓度,初步尝试后的调整。下面,我们来看看小白的“给药闯关记”
关卡一:牛刀小试
小白有肾癌细胞系-O,实验目的是验证新买的药物Erastin可以诱导-O发生铁死亡。于是小白文献搜索,他打开了谷歌,输入了关键字cell-OErastin,搜出了以下文献。
图1.关键字搜索相关文献
小白若有所思地打开了其中一篇Nrf2repressesERstress-relatedferroptosisinrenalcarcinomacellsviaHO-1,在这篇文献中,文献作者使用不同浓度(1-40μM)处理细胞24小时,MTT法检测细胞活力,结果表明10μM时就表现出显著性差异。而且该文中,作者还选用了10μM这个浓度进行了细胞超微结构观察进一步确定铁死亡。当然,勤快的小白还看了其他文献。最后,小白用1-40μM的浓度梯度,24和48小时2个时间梯度进行实验,并拿到了想要的实验结果。
图2.Erastin诱导铁死亡
A:MTT检测细胞活力;B:细胞超微结构观察
关卡二:一石二鸟
上面提到小白证明了Erastin诱导-O细胞的铁死亡。现在小白手里有个实验室自己合成的药物X,未知是否具有保护细胞免受铁死亡的作用。小白又一次上了谷歌,输入关键字:Erastin,ferroptosis,cell,protect,inhibitor。小白通过文献查阅发现,不同的文献中,要证明某种药物对铁死亡的保护作用,大多数情况下会将该药物在诱导剂之前预处理,文献中往往会出现(pretreatment,pretreated等字眼),当然也不完全排除同时给药的可能性(withorwithout等字眼)。不同文献中的验证方法也是“多姿多彩”。首先,最简单的是检测细胞活力测定,如图3A,MTT结果显示,提前用不同抑制剂处理过的-O细胞活力明显上调。图3B中,在原代胰岛细胞中,使用乳酸脱氢酶测定法(LDHrelease为检测指标)进行细胞活力测定,结果表明Ferrostatin-1,DFO的提前预处理可明显下调Erastin诱导的LDH释放。其次较为常见的就是ROS测定与胞内脂质过氧化测定。如图3C,SH-SY5Y细胞中,Erastin处理会导致细胞中ROS活性氧水平增加(DCFH-DA活性氧探针检测),但是铁死亡抑制剂DFO会显著减少Erastin诱导的活性氧增加。图3D,Hela细胞中,用C11-BODIPY染料进行脂质活性氧测定,结果表明药物预处理显著增加脂质活性氧的积累。
图3.不同方法证明某药物对铁死亡的保护作用
A:不同抑制剂提前预处理-O细胞;B:乳酸脱氢酶法测定细胞活力;C:ROS探针检测活性氧;D:胞内脂质活性氧的检测
看完以上文献,小白有了一些想法,他设置了以下分组(Table1.小白的实验分组),并且在MCE购买了文献中常用的铁死亡抑制剂Ferrostatin-1作为阳性对照。根据文献设置了不同时间梯度,又一次得到了想要的实验结果。
Table1.小白的实验分组
关卡三:多重变量
拿到了上述结果后,新的问题又来了。小白需要沉默掉其他通路一个基因,验证他的小分子化合物可能与该通路有关。那么现在至少有基因沉默,诱导剂,药物X三个变量了!小白又认真看了很多用到siRNA,小分子化合物的文献。如在MDM2andMDMXpromoteferroptosisbyPPARα-mediatedlipidremodeling这篇文献中,作者目的是证明MDMX存在时,可独立于p53促进细胞对铁死亡的敏感度(图4A)。WesternBlotting结果证明siRNA成功敲低SK-Hep1和SK-Hep1p53KO细胞中Mdmx的表达(图4B)。使用siRNA敲低MDMX时,相对siCtrl组,在SK-Hep1以及p53KO细胞中Erastin诱导的铁死亡程度均被显著降低(图4C)。并且,siMDMX的抑制作用不是短暂的,并且在给药后至少48h内会持续一定程度(图4D)。综上所述,Erastin诱导的铁死亡需要MDMX,而MDMX发挥作用独立于p53。
图4.不同方法证明某药物对铁死亡的保护作用
A:MDMX抑制剂作用机制简图;B:siRNA沉默Mdmx表达;C:Erastin诱导的p53KO细胞铁死亡;D:细胞活力测定
基于查到的文献,小白将他的实验优化成了2步:先确保siRNA转染成功,再加小分子化合物进行实验。热火朝天的小白,再一次拿到的实验结果。组会上,老师听着小白的工作汇报,点头露出欣慰的目光。真是一段充实的时光,小白从内心发觉:实验目的明确,多多查阅文献,实验过程中有的放矢的循序渐进,效果简直绝绝子。总结:看着小白的实验历程,小M建议,无论做什么实验,一定要明确心中所求,基于已经发表的文献中“取经”,设计自己的实验。其次,保持乐观的心态,胜败乃兵家常事,循序渐进,不断改进,相信SCI在向你疯狂招手。
相关产品
Erastin铁死亡(ferroptosis)诱导剂,结合且抑制电压依赖性阴离子通道(VDAC2/VDAC3)。
Ferrostatin-1选择性的ferroptosis抑制剂,人工合成的抗氧化剂,通过还原机制来防止膜脂的损伤,从而抑制细胞死亡。
GoPKC的泛抑制剂,对PKCα,PKCβ,PKCγ,PKCδ和PKCζ均有效。
CCK8细胞活性和细胞毒性检测的快速、高灵敏度试剂盒。
MTT可用于细胞增殖,活性毒性的检测。
H2DCFDA用于检测细胞内活性氧(ROS)水平的探针。
MCE的所有产品仅用作科学研究或药证申报,我们不为任何个人用途提供产品和服务
参考文献1.YuanqingShen,etal.Nrf2repressesERstress-relatedferroptosisinrenalcarcinomacellsviaHO-1.Biorxiv2.AMJamesShapiro,AntonioBrunietal.Ferroptosis-inducingagents