初期白癜风能治愈吗 http://baidianfeng.39.net/a_ht/131204/4302316.html演讲者：刘洁
整理者：胡秀琼
审稿者：许缤王超宁永忠
来源：医院感染管理年会
感染可能是由多种病原体引起的，对于这些病原体的检测需要多种诊断方法，如常见的有显微镜观察、细菌培养、酶联免疫吸附测定、聚合酶链式反应，每种方法结果形式不一样，分析结果也比较困难。所以在临床上，经常是不做检验而采取经验治疗，或者只做一种或几种病原体的检测。
对多种病原体同时进行检测多用于科研，但存在多种弊端。首先各种试剂价格昂贵；其次需要培训有经验的人员，耗时长；再次检测是交叉的，工作流程是间断的，结果只是定性的；最后各种方法检测灵敏度不同，所以分析起来一样很困难。与此相比分子诊断需要的试剂比较单一，只需要核酸提取、PCR的试剂盒和相应的仪器设备。所以近年来分子诊断的方法逐步应用于感染病原体的检测。
早在年的全国感控年会上，来自美国弗吉尼亚大学的刘洁副教授就重点介绍了研究团队开发的TaqManArrayCard（TAC，探针芯片）以及TAC的应用。
IDSA的一篇综述指出，分子诊断可以填补微生物病原体检测的某些空白，尤其是对症状检测，如脓*症、肺炎、脑炎、腹泻需要高度多重化的、一步化的分子测试方法。实验室得到比尔盖茨基金会的资助，比较了不同的分子诊断方法对肠道病原体的检测：
第一种是PCR.Luminex（液相芯片）是做PCR的终端扩增，扩增产物，与连在小柱子上的探针进行杂交，然后通过激光就可以识别出不同的病原体。
第二种是MultiplexRealtimePCRpancls（多重实时定量聚合酶链式反应）就是对探针进行荧光标记来达到检测不同病原体的目的。
第三种是TaqManArryCard（探针阵列卡）最初是用于基因表达的，我们是用它做病原体检测。就是基于实时定量的，以实时定量PCR作为基础的，但做成了微流体阵列卡的形式，每个卡上可做8个样品，每个样品联通了48个生物的反应孔，所以它是通过阵列分割的形式实现病原体的多重检测。
十九种病原体的检测：
首先是PCR引物和探针设计，然后根据CLIA、CLSI和CAP指南，对这些设计进行监测和验证，最终把这些试剂运到5个国家的实验室：巴基斯坦、孟加拉、泰国、坦桑尼亚、甘比亚，在当地进行分析性样品和临床样品核查，包括线性、可重复性、再现性、灵敏度、特异度、携带污染、干扰物质——这些指标在五个实验室呈现一致性，这5个实验室共检测将近个临床样品。将分子诊断方法综合起来作为一个金标准，与“传统”检测结果比较，“传统”检测方法的灵敏度是参差不齐的，即使是同一种方法如细菌培养，最高有80%的灵敏度，最低只有30%的灵敏度，而特异度还是比较高的。三种分子诊断方法对临床样品的测试结果相近，不管是灵敏度还是特异度都比较类似，三种方法都可以有效的检测到多病原。那么哪一种方法更适合临床实验室的应用呢，大家一致的看法是TaqManArrayCard（TAC，探针阵列卡）。TaqManArrayCard（TAC，探针阵列卡）是基于实时定量PCR的孔微流体阵列卡，通过空间分隔实现多重化，其组合式构造对引物和探针设计的要求相对低，可根据需求增减检测的病原体，步骤简单，采购成本低。
检测步骤：
核酸提取，提到的总核酸加入PCR试剂盒混合以后加到板上，再通过离心，在离心的过程中反应液就进入到48小孔中，分卡48小孔，每一个都成为一个独立反应体系，剪裁掉加药孔，放到机器里运行，从样品到出结果大约需要3-4小时。目前我们已有的设计：包括三十多种细菌，三十多种病*，十几种寄生虫，几种真菌，还有一系列已知常见的耐药基因，可以根据课题的需要或项目的需要组合这些病原体来进行检测。
目前已经发表的TAC有用于症状监测的多病原TAC，包括美国CDC开发的呼吸道TAC，我们实验室开发的肠道TAC和CDC资助下我们做的急性发热性疾病TAC。我们实验室还做了一些单病原耐药性基因和血清分型，包括结核及耐药基因分析、疟原虫及耐药性基因分析、肺炎链球菌血清分型。
应用举例：
首先是肠道TAC，我们对GEMS样品进行了重新分析，在腹泻病因方面是一个里程碑式的工作，发表在的柳叶刀上，在7个国家对0-5岁儿童进行一个病例对照研究，随机抽取了对样品进行了检测，用了TAC卡片上32种病原体。
在之前的研究中，人们发现粪便中病原体的数量与腹泻发病是有一定的关联关系的，在病原体数量比较低的时候不引起腹泻，而随着病原体数量的增加才引起腹泻的发生。各种方法检测的灵敏度，如细菌培养灵敏度相对较低，只会检测到比较高的病原体数量，而PCR尤其是MultiplexRealtimePCR就过于灵敏了，检测到与腹泻没有关系的那部分病原体，那么怎么样才能找到最佳的检测点来显示这种与腹泻的相关性？通过GEMS这个课题，对病原体的数量与腹泻的发病关系进行了深入的分析。以志贺菌属为例，随着病原体数量增加与腹泻的关联度急剧的增加。通过这种分析我们可以检查所有的病原体，按临床病例中检测的比率，从高到低排序，第一位是大肠埃希菌，检测率很高，即使在很高病原体数量下，其与腹泻发病没有关联度的，，但轮状病*的数量和腹泻就有很强的关联。所以通过这样的分析，我们对每一个病原体在腹泻中起的作用有了一个明确的分析，然后就可以对病原体特异性的疾病负担做一个评估。
这个项目分成三个年龄段：0-1岁，1-2岁，2-5岁，在0-1岁年龄组对于轮状病*和隐孢子虫传统检测方法与TAC检测是类似的，而对于腺病*用TAC方法高出3-4倍，在第二个年龄组里用传统方法志贺菌属是排在第二位的，在轮状病*之后，但用TAC检测增加了一倍多，跃居到第一位，在这个年龄组里成为最重要病原体。用传统的方法，有52%的腹泻可以归结为某一种病原体，但在应用了TAC以后，我们把这个比率提高到89%。还有一点，在这个项目中很有趣的发现，把水性腹泻和痢疾分开了。大家都知道志贺菌属是造成痢疾的主要因素，但出乎意料的是志贺菌属在水性腹泻中也有一部分，并且仅次于轮状病*，所以这部分是大家容易忽视的。WHO对于腹泻治疗的一个指南里就提到只有带血便即疑似志贺菌属感染才会给抗生素，忽视了水样腹泻。我们对由大肠埃希菌、轮状病*所致的症状做了比较，没有太大区别的，所以通过这个研究提出了对腹泻的治疗需要进一步探讨，也提出了对于病因的确切分子诊断是很有必要的。
这些在群体上的发病率可用于全球疾病负担的评估。年的评估，采用的GEMS用传统方法取得的研究结果，41%找不到病原体，但在年用TAC检测方法重新评估，仅有3.1%找不到病原体，大大缩小了诊断空白。
以上是在群体水平上的情况，我们也可以看看病例个体水平上的情况。可以在个例水平上，确定致病临界值。这样在单一微生物或混合微生物时，可以进行分析。可以看到：一种情况是在这个病例样品中，只有一种导致腹泻的病原体；还有一种情况是有几种病原体，但某一种是致病相关性最高的，其它的不是最高的，所以就需要看每一种病原体在腹泻中起的作用。如志贺菌属、轮状病*或者是独立存在的，或者是首要的，只有一小部分是次要的，或者与腹泻没有关系的。有的病原体或者是能够检测到，但量不足以引起腹泻，如腺病*大部分以次要形式存在。这些研究结果是病例对照研究得出的，对没有做病例对照项目的起到借鉴作用。
如世界卫生组织轮状病*网监测的一个项目，在5个地域性实验室做了试点，全部是腹泻病例，是没有对照的，共有十六个国家参与，检测率第一是轮状病*，第二是大肠埃希菌，前面提到大肠埃希菌与腹泻是没有关系的，如果我们分析与腹泻有关系的病原体时，是可以不加考虑的，所以首要还是轮状病*，然后是诺如病*，还可以看到各个地区病原体的分布情况。实际上TAC的应用是方方面面的，这个项目还在扩大，中国很快也会参与其中。
简单介绍TAC在发热方面的应用。在乌干达的一个项目，检测的是严重的脓*症症，多数是艾滋病人，这些样品之前做了细菌培养，所以我们可以与之前细菌培养结果进行比较。血流里细菌的滴度很低，尤其是沙门菌，经常小于1cfu/ml，对于检测是很有挑战性的，我们得到的灵敏度总体大约是百分之六十到七十。对于细菌培养阴性的结果，相当一部分检测到了肺炎链球菌、大肠埃希菌和结核分枝杆菌，对病因分析是有益的补充，另外还有一些培养得不到的病原体如病*、细菌，检测率在0.3-3%，尤其是巨细胞病*可以高达37%，这与艾滋病人群是有关系的。
第二个项目是在坦桑尼亚疫病暴发的调查，第一个例子是发热、腹泻，用发热的TAC做血液样品的检测，肠道TAC做粪便样品检测，两个卡上检测的结果都是伤寒沙门菌阳性，细菌培养结果也是伤寒沙门菌阳性。另一个例子是急性肝功能衰竭，不发热，怀疑是传染病，比如*热病、戊型肝炎，用发热TAC做血液样品检测，所有的14个样品都是阴性的，排除了感染的可能，最终结果是*曲霉素*素中*。之前讲到在血流感染中，PCR的灵敏度有限，但是对于疫病暴发的调查，如果样品量达到一定程度，还是可以起到确定病原或排除病原的作用。
我们在坦桑尼亚对住院发热病人的监测中，做了发热TAC和呼吸道TAC，检测结果在发热TAC中最多的是疟原虫，其次是细菌，除了沙门菌以外，其它的都是难以培养的。呼吸道TAC主要检测的是细菌和病*。所以对某些特定的人群是可以做多方面的综合性的检测。
之前介绍的发热TAC检测的病原体是不同的，所以我们完全可以根据课题的需要来选择不同的病原体。如一个非洲急性发热的项目，我们考虑主要是一些病*，还有一些不能培养的细菌。最近跟美国CDC合作，在亚非南美9个国家包括中国，进行的寨卡病*检测，也包括其它的急性发热的病原体，因为有亚洲和南美洲，所以加了一些与地域性有关的病原体。最后一个是新生儿脓*症，这个群体需要快速而有效的检测手段，所以TAC检测主要是细菌，加了一些新生儿高发的病原体。所以关键是对于每一个TAC，检测的侧重点是可以不同的。
对于单病原的TAC，如检测结核耐药性的卡，可检测与7种抗生素有关的耐药基因。检测疟原虫的卡除可检测抗药性，还可鉴定菌种和基因型。
结论：
通过这些研究和课题，认为探针阵列卡能够同时检测多种病原体，适用于症状监测和疫病暴发调查，可到检测传统方法不能检测的病原体。TAC所检测的病原体可以根据需要灵活组合，用于确定或排除病原体，如果有需求也可以做院感病原体及耐药性方面的检测。且其定量分析，有助于高分辨率地解析与疾病的关联
图文：朱迪
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