近日，一篇发表在Virulence上的文章表明了重组乳酸菌可以作为口服疫苗有效地诱导针对产气荚膜梭菌α、ε、β1和β2类毒素的保护性免疫。
产气荚膜梭状芽胞杆菌是一种革兰氏阳性，可形成孢子的厌氧菌，广泛分布于自然环境中，外毒素是其主要毒力因子，不同类型的毒素引起不同的疾病。目前在饲料中添加抗生素是控制牲畜中产气荚膜梭菌感染的最有效方法，但抗生素可能对环境和人类健康造成负面影响；因为产气荚膜梭菌是动物胃肠道中的条件病原体，其肠毒素可通过肠粘膜吸收。因此，需要能够诱导更有效的基于sIgA的粘膜免疫的口服疫苗来预防产气荚膜梭菌疾病。乳酸杆菌是革兰氏阳性、兼性厌氧或微需氧、杆状、无芽孢的细菌，是在人类和动物的食物和肠道中发现的最常见的益生菌，可以在上消化道的恶劣环境中存活并在肠道中定植。因此，乳杆菌被广泛用作表达异种标志抗原的口服疫苗递送载体，从而通过口服给药诱导有效的免疫反应。
本研究中研究人员以干酪乳杆菌为抗原传递载体，成功构建了一株表达产气荚膜梭菌α、ε、β1和β2毒素的无抗性基因的工程菌株pPG-Δ-E-α-β2-ε-β1/L.casei。为了评估其作为口服疫苗的免疫性能，随机将小鼠分为重组乳酸菌组（pPG-Δ-E-α-β2-ε-β1/L.casei）、空载体对照组（pPG-T7g10-PPT/L.casei）、空白对照组（PBS）、重组乳酸菌对照组（具有氯霉素抗性的重组乳酸菌pPG-2-α-β2-ε-β1/L.casei）和疫苗组，第0、1、2天连续三天进行口服免疫，第14、15和16天进行强化免疫，第28、29和30天进行第二次强化免疫后，取样进行相关免疫能力的测定。
首先在小鼠身上进行重组乳酸菌的定植能力测定，结果表明cFDA-SE标记的乳酸菌经口服后可以存活并粘附在小鼠的十二指肠、空肠、回肠和结肠上。口服第1天，十二指肠、空肠、回肠和结肠中乳酸杆菌存活率分别为65.9%、86.7%、67.2%和78.2%，到第15天，存活率分别为10.3%、19.5%、13.8%和15.2%。说明重组乳酸菌有着非常好的粘膜和肠道定植能力。
随后，研究人员通过ELISA试验证明了重组乳酸菌能有效诱导小鼠产生粘膜和全身免疫反应，且与其他4组相比，小鼠体内抗α/β2/ε/β1类毒素蛋白特异性IgG水平显著提高，同时在粪便及粘膜中也检测出高水平的sIgA。重组乳酸菌经第二次增强免疫后，显示出较好的免疫原性，而空载体对照组和空白对照组免疫前后无显著性差异。同时检测了初次免疫后35天采集的血清中IL-4、IL-12、IL-10、IL-17、IL-2和IFN-γ细胞因子的水平，结果表明，与空载体对照组或空白对照组相比，口服重组乳酸菌组的小鼠血清中细胞因子的水平显著提高。
为检验重组乳酸菌的免疫保护效果，在初次免疫后的35天，随机将各个组的小鼠分为2个亚组，一个亚组小鼠肌肉注射1×LD的A型、C型和D型产气荚膜梭菌产生的类毒素混合物，另一个亚组的小鼠口服2×CFU的A型、C型和D型产气荚膜梭菌的混合液进行攻毒。结果表明肌肉攻毒组的重组乳酸菌组、重组乳酸菌对照组和疫苗组小鼠的存活率分别为80%、70%和60%，对应的口服攻毒组存活率分别为80%、70%和50%，PBS组的小鼠全部死亡，说明重组乳酸菌能提供更有效地免疫保护。攻毒后对各组小鼠的肝、肠、肾、脾、心、脑进行组织病理学观察，与对照组小鼠相比，重组乳酸菌组小鼠心、脾、肠、脑组织无明显病理学改变，但肝脏和肾脏中发现轻微的充血和出血变化。疫苗组、空载体对照组和PBS组小鼠肠道组织病理学改变最为明显，包括肠道结构完整性严重破坏、肠上皮坏死、绒毛缩短。此外，在空载体对照组和PBS组小鼠肾脏和肝脏的组织学切片中可见明显的充血、出血、肾小管上皮细胞变性/坏死和炎性细胞。结果印证了口服重组乳酸菌可以更好的保护小鼠的各组织器官不被产气荚膜梭菌破坏。
此外，淋巴细胞增殖率与细胞免疫呈正相关，因此，研究人员检测各组小鼠脾淋巴细胞的增殖情况。结果表明，重组乳酸菌也能诱导细胞免疫应答，其诱导的Th1型（IL-2、IL-12、IFN-γ）和Th2型（IL-4、IL-10、IL-17）细胞因子水平显著高于对照组；同时重组乳酸菌组小鼠脾细胞中CD4+和CD8+T细胞百分率显著增加，说明重组乳酸菌可促进CD4+和CD8+T淋巴细胞的增殖。
这项研究证明，重组乳酸菌pPG-Δ-E-α-β2-ε-β1/L.casei可通过口服有效诱导粘膜、细胞和体液免疫应答，与其它诱导表达系统的乳酸菌相比，口服组乳酸菌pPG-Δ-E-α-β2-ε-β1/L.casei对产气荚膜梭菌毒素和产气荚膜梭菌感染具有更为有效的保护作用，为开发产气荚膜梭菌口服疫苗提供了一个很有前景的候选方案。
参考文献：DingGuojie,BaiJing,FengBaohua,WangLi,QiaoXinyuan,ZhouHan,JiangYanping,CuiWen,TangLijie,LiYijing,XuYigang.AnEGFP-markedre