软骨损伤非常普遍，并导致关节功能障碍，现有的关节假体无法与宿主关节组织重塑，然而，开发大尺度、各向异性的工程化软骨组织仍然是个巨大挑战。上海交通大学医医院的戴克戎院士课题组最近在Scienceadvances期刊上发表了“3Dbioprintingdual-factorreleasingandgradient-structuredconstructsreadytoimplantforanisotropiccartilageregeneration”文章，通过3D打印构建了具有双因子释放和梯度结构特征的各向异性软骨组织，这种融合3D打印和间充质干细胞治疗的技术为关节修复提供了新的治疗方法。
软骨修复
关节软骨是关节中的弹性结缔组织。软骨的损伤导致关节功能障碍，即关节炎，使患者面临巨大的疼痛甚至残疾风险；然而由于软骨的低细胞含量和无血管特性，其具有非常有限的自修复能力，因此软骨关节的重建仍然是相当大的挑战。目前，关节炎的临床治疗主要为将病损关节由金属和聚合物的假体代替，但关节假体无法与宿主关节组织进行重塑，并可能发生关节松动或感染而导致长期衰竭。相比而言，人造生物关节具有显著的优势。目前使用间充质干细胞（MSC）移植，并刺激其定向分化为软骨细胞，正成为体内软骨修复的首选方法。随着关节软骨从浅表区过渡到深层区，软骨中细胞外基质(ECM)沉积和细胞类型的梯度分布和各向异性结构特征，为深层区提供了优异的渗透性能和所需的机械性能。
然而，在软骨修复中，开发能够模拟软骨的梯度、各向异性结构特征，以及不同层中的信号传导机制的仿生软骨结构，来诱导区域依赖性的软骨定向分化和ECM沉积，仍然是当前最大的挑战。以往研究表明，具有较小孔径（~μm）的支架可以更好地促进骨软骨再生中的软骨形成。然而，支架孔径过小抑制了成骨形成和血管生成，不利于氧和营养物质的传递和与宿主组织的整合。另一方面，相关研究将水凝胶用于软骨再生，然而由于其较差的力学性能和打印性能，仍然难以用水凝胶来构建大尺度的软骨组织。基于此，本研究使用3D打印技术构建了具有双因子释放、梯度结构的载MSC的软骨组织，并通过动物模型验证了体内软骨再生修复的有效性。
图1.正常关节和关节软骨结构
实验方法
3D打印软骨结构
该团队使用3D生物打印技术（OPUS,Novaprint）构建了梯度化的水凝胶/PCL复合软骨支架，分别构建了尺寸为4mm×4mm×4mm的兔软骨支架和14mm×14mm×14mm的人软骨支架，水凝胶和PCL纤维的直径分别为μm和μm。其中，诱导软骨形成的刺激包括具有多种生长因子释放的生物化学刺激（BCS），和梯度化孔径结构分布的生物力学刺激（BMS），以及同时具有因子释放和梯度结构的双重刺激组（DS）。具体而言，构建了PCL纤维间距从μm到μm逐渐变化的梯度化支架；生长因子包括骨形态发生蛋白（BMP4因子）和转化生长因子β3（TGFβ3因子），使用了聚乳酸-乙醇酸（PLGA）微球作为因子载体，并混合MSC细胞进行水凝胶打印。为了模拟天然软骨中不同层区的化学刺激，载BMP4因子的水凝胶微丝分布在最深层（丝距为μm），而载TGFβ3因子的水凝胶微丝分布在表面三层（丝距为μm~μm）。
图2.研究设计方案和支架结构的示意图
图3.3D打印梯度化的水凝胶/PCL复合软骨支架过程
生长因子对骨髓间充质干细胞（BMSCs）的影响
骨髓间充质干细胞（BMSCs）从兔骨髓中分离出来，并在基础培养液中进行体外培养。BMSCs传代两次后，加入10ng/ml的TGFβ3因子培养两周，然后替换为50ng/ml的BMP4因子继续培养四周，保持每周换液两次。然后进行免疫荧光染色，其中Col1A1,Col2A1,Aggrecan,和Col10A1为软骨细胞的特异性蛋白，用于检测软骨细胞的不同亚型；并通过实时定量PCR技术来检测相应基因的表达，其中SOX9,Col1A1,和Col2A1为软骨形成的相关基因，而ACAN,PRG4,CILP2,GDF5,和Col22A1为表层软骨的特异性基因，Col10A1,RUNX2,和ALP为深层软骨的特异性基因；进一步，用甲苯胺蓝（toluidineblue）和阿利新蓝（alcianblue）来检测软骨中蛋白多糖（GAGs）的形成。
体外生物学评价
体外培养6周后，收集支架并用PBS清洗3次，切成4层并在显微镜下观察。其中，用活死染色分别测试支架在第3天、7天和21天的细胞活性，并用Phalloidin染色观察第21天的细胞形态；用alamarBlueassaykit(DAL1;LifeTechnologies)来检测细胞的增殖特性；每一层分别检测蛋白多糖的含量，同时进行免疫荧光染色来分析不同层中特异蛋白的表达量。
体内植入评价
首先，不同组的支架在裸鼠（Nudemice）背部皮下植入12周，并取样进行免疫荧光染色，来检测蛋白多糖4（PRG4）、聚集蛋白聚糖（aggrecan）和II、X型胶原等蛋白在不同层的表达情况。进一步，采用新西兰成年雄性白兔作为动物模型，用角膜环钻在股骨远端构建直径4mm和高4mm的圆柱状缺损，得到兔膝关节软骨缺损模型，并分为三组，用于力学刺激（BMS），化学刺激（BCS）和双重刺激组（DS）支架的体内植入；支架样品植入后用缝合线缝合，然后通过肌肉注射抗生素来预防术后感染；数周后取样，进行免疫荧光染色，通过显微观察并计算再生软骨的厚度。
实验结果与分析
双因子缓释、梯度化软骨支架的打印
与天然软骨类似，COL2A1（II型胶原Alpha1链）和PRG4（蛋白聚糖4）作为润滑层透明质软骨细胞的特异性蛋白标记，其在具有较小孔径的支架表层中的表达量明显偏高，而根据COL10A1的表达显示，在支架深层中的成软骨细胞大多呈现肥大表型。此外，丝距为μm支架和梯度化支架的杨氏模量与天然软骨相似，都明显高于丝距为μm的支架，证明较小的PCL纤维间距能够有效增强PCL/水凝胶复合支架的机械性能。在人工软骨的再生过程中，梯度化支架有利于各向异性的软骨生成，并促进支架深层的营养供给和血管生长。
图4.梯度化软骨支架的打印和生物学表征。
双重因子释放对BMSCs体外活性和增殖的影响
PLGA微球具有因子缓释特性，其中TGFβ3因子在支架表层具有较快的释放速率，而BMP4因子在支架深层的释放速度相对较慢，可以维持在60天以上。打印的载MSC水凝胶中，细胞沿纤维纵向排列，并相互连接形成网络，同时PCL纤维提供了结构稳定性。活/死细胞染色结果表明，刚打印的细胞活性≥95％，在第3天到第21天仍保持超过75％的活性。
图5.梯度化软骨支架内细胞活性和增殖特性的表征。
生长因子的时空释放模式对软骨基质分泌的影响
在支架的体内植入之前，首先需要确定TGFβ3因子和BMP4因子的时空释放模式能否诱导BMSC向软骨细胞的分化，并表现出不同软骨层特异性的特点，即分别透明质和肥大软骨细胞等表型。具体而言，透明质软骨细胞能够产生聚集蛋白聚糖和II型胶原，而肥大软骨细胞产生I型胶原和X型胶原。基于此：
在体外培养中，先用TGFβ3因子刺激2周，再继续用TGFβ3因子刺激4周，此时BMSCs诱导分化的软骨细胞能够分泌聚集蛋白聚糖和II型胶原蛋白，同时软骨组织的形态接近于成纤维细胞特点，即具有透明质软骨细胞的特点；
而先用TGFβ3因子刺激2周，再用BMP4因子刺激4周，BMSCs诱导分化的软骨细胞能够分泌出比对照组明显更高的I型，X型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖，同时BMP4因子诱导的软骨组织主要以鹅卵石图案排列，具有肥大软骨细胞的特点。
总之，两种生长因子处理均能诱导BMSC分化为软骨细胞，并分泌出富含蛋白聚糖的软骨样ECM。
进一步，体外培养12周，单独BCS和BMS刺激的支架只生成1/4~1/3厚度的软骨样组织，而双重刺激（DS）组则生成了全层覆盖的软骨样组织。皮下植入12周，支架表层由于TGFβ3因子的缓释使得其主要分泌透明质软骨细胞的特异性聚集蛋白聚糖和II型胶原蛋白，而支架深层区由于BMP4因子的缓释主要分泌肥大软骨细胞特异性的X型胶原，这种生长因子时空调控的特异性蛋白分布，与天然软骨关节接近。并且，体内诱导生成的软骨样组织在不同层的形态特点，同样也与体外培养结果相一致。
体内软骨修复效果评价
将双因子释放和梯度结构支架植入到兔膝关节软骨缺损模型内，以评估软骨支架的膝关节修复效果。与单独BCS和BMS支架相比，DS支架在第8、12和24周的软骨修复表现出更好的总体外观；移植24周后，对膝关节进行了磁共振成像，实验结果表明DS组在24周后软骨下水肿的分辨率和关节表面的愈合效果都明显更好。此外，与非梯度支架组（NG）相比，梯度支架组在体内24周内显示出更好的软骨保护作用，组织学评分明显更高，在24周内具有更好的软骨修复效果。另外，相比于BCS或BMS组，DS各向异性支架具有更好的软骨修复效果，并且移植后保持较好的关节功能，能够促进深层区内宿主血管的长入。
图6.双因子释放和梯度结构支架在兔膝关节软骨缺损模型内修复效果评价。
总结
开发能够模拟软骨的梯度化、各向异性结构以及不同层中特异性信号传导机制的工程化软骨组织，仍然是当前软骨再生领域中的主要挑战之一。本研究使用3D打印技术构建了具有双重因子释放、梯度结构特征的载MSC的各向异性软骨组织，其中，具有双重因子释放功能的载间充质干细胞（MSC）水凝胶具有区域依赖性的软骨定向分化和ECM沉积的特点，同时3D打印的梯度化PCL纤维结构赋予了软骨组织必需的机械强度。进一步的体外和体内实验证明了工程化软骨的全层结构完整性、功能性和良好的修复效果，证明该技术将有望进一步应用于患者的临床治疗。
参考文献
Sun,Y.,etal.,3Dbioprintingdual-factorreleasingandgradient-structuredconstructsreadytoimplantforanisotropiccartilageregeneration.SciAdv,.6(37).（DOI:10./sciadv.aay）