类器官（organoids）是指利用干细胞、祖细胞、肿瘤细胞等在体外培养出的3D细胞培养物并具有一定的空间结构组织类似物。年，类器官技术被列为“十四五”国家重点研发专项[1]，作为疾病模型，相比于传统2D疾病模型，类器官在阐明疾病的发展、稳态性和发病机理等与体内环境更加接近，在多领域将发挥重要，诸如细胞治疗、药物研发、基因工程、免疫研究、组织再生等领域。
图：类器官的应用方向[2]类器官主要由成体干细胞或肿瘤样本在适宜的培养条件下构建。类器官的整体培养体系包括组织消化、清洗、处理、培养基配置、基质胶与细胞的混合、培养、观察等步骤。其中，细胞悬液与细胞外基质（基质胶）混合是关键的步骤之一，为类器官提供3D生长载体。基质胶主要成分由层粘连蛋白，Ⅳ型胶原，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）和巢蛋白等组成，还包含生长因子如TGF-beta、EGF、IGF、FGF、组织纤溶酶原激活物和EHS肿瘤自身含有的其他生长因子。为组织和细胞提供支撑、抗拉强度和支架支撑等。翌圣生物开发生产的CeturegelTM基质胶不含LDEV（乳酸脱氢酶增高病*），超低内*素含量，并全部经过支原体检测保证无支原体污染，包括基本浓度、高浓度、低生长因子等不同类型基质胶。
Ceturegel?基质胶
应用方向
产品特点
小鼠小肠类器官构建
实验步骤
1.样本制备：小鼠断颈处死，表面喷洒酒精杀菌。在无菌环境下截取出近胃端处3~15cm肠组织，用镊子小心去除肠道外部的肠系膜、脂肪，放入4℃预冷的含1%双抗的DPBS溶液中。2.样本清洗：使用注射器冲洗肠道2-3次，用手术剪将肠管小心剪开，肠腔面朝上，手使用手术刀片轻轻刮去肠腔表面肠绒毛，待肠绒毛被刮净后（呈现组织透明），将肠组织置于新的含DPBS的培养皿中清洗2~3次。3.样本初处理：将清洗后的小肠组织剪碎至2mm宽大小块状体，顺势转移至新的50ml离心管中，用DPBS轻柔清洗3-5次，除去肠绒毛细胞和漂浮脂肪组织。4.样本消化：在清洗好的小肠碎片组织加入10-15ml含有3-5mMEDTA的预冷DPBS中消化，4℃孵育30min左右，期间每10min轻摇一次离心管。5.消化完成后，弃去EDTA消化液上清，用新的DPBS缓冲液将组织轻柔漂洗2~3次以去除剩余的EDTA。6.在小肠组织碎片中加入10~15ml预冷的含0.1%BSA的DPBS，反复吹打、重悬组织碎片，使隐窝与基底层分离，然后取少许悬液镜检，当看有大量隐窝样结构后，停止吹打，并对吹打后的组织悬液使用70μm滤网过滤并收集穿过滤网的组织悬液。7.重复步骤5-6两次，rpm、4℃离心3min。8.混合物形成：用Ceturegel?基质胶重悬隐窝组织沉淀，每10μL基质胶悬液包含~个隐窝，重悬后混合液置于冰上，尽快操作以避免基质胶形成凝胶。注意：基质胶稀释比例≥50%以保证培养过程中Ceturegel?基质胶结构的稳定性。9.将混合悬液种植于24孔板底部正中央，每孔30~50μL左右，避免悬液接触孔板侧壁。10.将种植后的培养板至于37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育30min左右待基质胶凝固。11.待Ceturegel?基质胶完全凝固后，沿壁缓慢加入已配制好的肠类器官培养基，每孔μL/孔。12.将24孔板置于37℃二氧化碳培养箱中培养。每3天更换一次新鲜培养基并监测类器官生长状态，一般小鼠小肠类器官在5~7天内形成。
实验结果
Day0
Day3
Day5
Day7
图：小鼠小肠类器官体外培养结果图
FAQ
1.消化组织选择什么消化液，消化时长是多少？组织的消化液可以选用EDTA或胶原酶，如果消化空腔性器官使用EDTA适合，如小肠和胃；胶原酶有不同类型，消化的组织类型比较广泛，可以搭配DNA酶一起。不同组织消化时间差异比较大，从十几分钟到数时小时。2.基质胶的操作要注意哪些事项？所有操作需在无菌环境下进行，应使用预冷的移液器以保证基质胶呈匀浆状。3.基质胶的如何分装冻存使用？可将冻融后的Ceturegel?基质胶分装在多个小管，所有分装均需用预冷的冻存管，迅速冷冻并保存，避免多次4.不同孔板培养类器官培养所需的基质胶和培养基体积?培养类器官常用的是24孔板培养，按50μl/孔形成胶滴，再加入~μl培养基覆盖胶滴；96孔板按10μl/孔形成胶滴，再加入μl培养基覆盖胶滴；6孔板每孔可以种植多个50μl胶滴，加入2~3ml培养基覆盖胶滴。
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